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间充质干细胞无血清培养基

简要描述:间充质干细胞无血清培养基MSC BeautiStemTM XF Medium,培养分离脐带间充质干细胞

  • 产品型号:
  • 厂商性质:代理商
  • 更新时间:2023-06-29
  • 访  问  量:1251
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应用领域医疗卫生,化工,生物产业,制药

 间充质干细胞无血清培养基

MSC BeautiStemTM XF Medium

一、目的:利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞。二、材料:新生儿脐带

三、主要仪器:医用手术器械,生物安全柜,CO2 培养箱,6 孔培养板,T25 培养瓶

四、试剂:

表 1 MSC BeautiStemTM XF Medium

 

品牌

货号

名称

规格

保存条件

NANOLAB

NA500

MSC BeautiStemTM   XF Basal Medium MSC 无血清基础培养基

500ml

4

NANOLAB

NAS03

MSC BeautiStemTM    XF Supplement

MSC 无血清添加剂

3ml

-20

NANOLAB

NAA01

MSC Attachment solution (100X)

MSC 贴壁试剂

1 ml

4

NANOLAB

P0500LT

 Human Platelet Lysate

血小板裂解物

500ml

-20

2 建议选用试剂

 

NANOLAB

NA079-100ML

Recombinant Trypsin-EDTA

Solution 重组胰酶-EDTA

100ml

RT

NANOLAB

NA048-20ML

Soybean Trypsin Inhibitor (50X)

大豆胰酶抑制剂

20 ml

-20

NANOLAB

NA712-10ML

MSC Freezing Solution MSC 冻存液

10 ml

4

NANOLAB

NA023-500ML

DPBS (w/o Ca & Mg)

DPBS 缓冲液

500 ml

RT

NANOLAB

NA031-100ML

Penicillin-Streptomycin

Solution(100X)青链双抗

100ml

-20

 

NANOLAB

NA35010100

MSC ACF Tissue Digestive Mix

ACF 高效原代间充质干细胞分离液

100ml

-20

五,实验前准备:

5.1  *培养基的准备

5.1.1 冻存的 MSC BeautiStemTM XF Supplement 在室温或 2-8℃解冻,避免反复冻融。

5.1.2   配制:MSC  BeautiStemTM   XF  Basal  Medium(培养基):MSC  BeautiStemTM   XF

Supplement(添加物):青链双抗=500ml:3ml:5ml,4℃保存,2 周内使用。

注 1:双抗非必须,建议原代(P0)时使用。

注 2:培养基含 L-Glutamine,贮藏时避免长期照光。

 

5.2  包被培养皿

或跳过此步骤,直接加 2%血小板裂解物(P0500LT),促进 MSC 细胞贴壁与生长。

          5.2.1 使用 DPBS 溶液(货号:NA023-500ML),将 MSC 贴壁试剂稀释 100 倍(1:100)。

          5.2.2 参照表 3,加入适量的 1XMSC 贴壁试剂涂层培养皿或板。

表 3  涂层过程中贴壁试剂建议使用量

 

培养器皿

表面积 cm2/孔或瓶

1X MSC 贴壁试剂使用体积

96 孔板

0.34

0.05~0.1 ml

24 孔板

1.9

0.2~0.4 ml

12 孔板

3.9

0.4~0.8 ml

6 孔板/ 35 cm 培养皿

9.6

1~2 ml

T25 瓶/ 60 cm 培养皿

25

2.5~5 ml

T75 瓶

75

7.5~15 ml

 注 1:涂层的培养皿需在无菌条件下 2℃-8℃储存,需在一周内使用。(标示红色为原厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用)

注 2:包被期间, 注意包被液不可以干掉!

注 3:若使用预包被培养瓶(Corning 的 CellBind,货号:3289/3290 等), 步骤 5.2 的包被可略过。

 

           5.2.3  轻轻摇动培养皿,确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后,用封口膜包裹涂层的培养皿。

           5.2.4 在 2-8℃孵育过夜;或者在 CO2 培养箱,37℃,至少孵育 30 分钟。

           5.2.5 接种前, 吸除贴壁试剂,再用 DPBS 轻轻冲洗培养皿,即可接种细胞。

 

5.3  制备 1X 大豆胰酶抑制剂

           5.3.1 使用无菌的 DPBS,将 50X 大豆胰酶抑制剂(NA048-20ML)稀释成 1X。

 

 

六、使用范例:

6.1  UC-MSC 原代培养 (组织块法)

             6.1.1 无菌条件下取新鲜脐带,用 DPBS 漂洗净血迹

*   一般脐带取得非无菌环境,可以稍微用 75%酒精润洗。

              6.1.2 置 10cm 培养皿中,剪成 1~2cm 脐段,剔除血管,用 DPBS 洗净血迹,再剪成 1mm3

组织块。(图 1)

               6.1.3 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。

               6.1.4  37℃,5%CO2 培养箱孵育 30min,以使组织块粘贴在培养皿壁上。

 

6.1.5  向每孔滴加 0.8ml *培养基 (注意沿孔壁小心滴加,勿使冲动组织块)。

 6.1.6  37℃,5% CO2 培养箱孵育过夜,次日 (D1) 每孔再补加 1ml *培养基。

                6.1.7 37℃,5% CO2 继续培养,5 天 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞,但快 3

天就可看到细胞从组织边沿爬出)。

           6.1.8 再过 5 天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出,但晚可到 14 天会出现细胞从组织边沿爬出) (图 2、图 3)。

 6.1.9 每 2 天换一次培养液,继续培养 2~4 天,待细胞融合度(Confluency)达到约 80%

后传代培养(图 4)。

注 1:组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁,换液动作要尽可能轻微,避免冲动组织块。培养基加量不能太多,以免组织块漂浮。

2:为增加成功率,从原代分离脐带和脂肪间充质干细胞, 培养基可加 2.5%的人 AB 血清(人 AB 型血清必须除菌过滤,且 HbsAG 及 HCV/HIV 抗体阴性)。

 

6.2  UC-MSC 原代培养 (消化法)

MSC BeautiStemTM  XF Medium 也能有效地培养消化法取得的原代细胞,操做方式可依各实验室的实验步骤,或参考上海中韬 MSC ACF Tissue Digestive Mix (货号:C35010010) 的使用说明。

6.2.1  将脐带用 DPBS 漂洗干净,剪成 1-2cm,后剔除血管。

*   一般脐带取得非无菌环境,可以稍微用 75%酒精润洗。

6.2.2 将组织剪成 3-5mm3 后,移入 50ml 离心管,再加入的分离液。

 

*   一条长度 10 公分的脐带建议加入 10ml 的分离液;或者组织块 : 分离液(vol)= 1:1。

** 视情况而定,可自行在分离液中添加 1%青链双抗(BI, Cat# 03-031-1B) 。

 

6.2.3 把 50ml 离心管横放在 37 度细胞培养箱,过夜反应(16 小时)。

 

*   若总反应体积较大,也可持续旋转混合。

6.2.4 加入和分离液等体积的 0.05%EDTA(NANOLAB, Cat#NA015-100ML)终止反应后,1500 xg 离心5 分钟,去除上清。

*   溶液比较浓稠,小心不要影响下层的细胞;建议留下 5ml 左右的溶液。

** 若是脂肪组织,没有粘稠的情形,以常规的 200-300 xg 离心即可。

*** 没有 EDTA, 可使用无钙镁 DPBS 取代;此时建议后面步骤 6 多重复 2-3 次,以确实去除酵素。

6.2.5 以和分离液等体积的无钙镁 DPBS 重悬细胞后,500 xg 离心 5 分钟,去除上清。

6.2.6 再次以和分离液等体积的无钙镁 DPBS 重悬细胞后,250 xg 离心 5 分钟,去除上清。

 

6.2.7 用适量的培养基重悬细胞后,即可按常规细胞培养方法接种 P0 代细胞培养。

*   消化后的原代细胞,建议培养时接种密度提高到 10,000/cm2 以上;传代后即可按常规的接种密度培养。

6.3  UC-MSC 传代培养与冻存

        6.3.1   待细胞融和度达到约 80%后进行传代(细胞不能太密集,否则容易分化),吸弃传代板孔中的培养基,每孔加适量 DPBS 轻轻冲洗 1 次。

         6.3.2  根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA(货号:NA079-100ML,T25 建议使用 1ml),在 37℃,5% CO2 培养箱作用 3~5 min(可轻拍培养瓶帮助细胞脱落)。

6.3.3 显微镜下观察细胞*脱落后, 根据重组胰酶-EDTA 使用量加入10 倍体积的大豆胰

酶抑制剂(1X),1000rpm 离心 3~5min。例:用 1ml 重组胰酶-EDTA,则加入 1ml

大豆胰酶抑制剂(1X)与细胞混和均匀,再离心。

             6.3.4谨慎吸出上清,细胞团块用适当体积的*培养基悬浮后,混匀细胞悬液。

             6.3.5 按照所需的比例进行传代或按照 5000-6000cells/cm2 的细胞密度将细胞接种至培养器皿中,放入 37℃, 5% CO2 培养箱内培养。

             6.3.6每 2-3 天更换一次培养基, 待细胞融合度达到 80% 左右时,参照操作步骤

6.3.1~6.3.5 做细胞传代;或者参照操作步骤 6.3.1~6.3.3 收获细胞冻存。

        6.3.7 细胞冻存:将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 冻存液(货号: NA712-10ML)中,装入冻存管,2~8℃冰箱放置 30min,-80℃冰箱放置 24h,转入液氮罐冻存。

:本方法仅供参考,用户可根据自身经验做合理调整。附图:(如下是组织块法,建议客户可以尝试消化法)

    
  
   

 

 


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