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品牌 | 其他品牌 | 供货周期 | 现货 |
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应用领域 | 医疗卫生,化工,生物产业,制药 |
间充质干细胞无血清培养基
MSC BeautiStemTM XF Medium
一、目的:利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞。二、材料:新生儿脐带
三、主要仪器:医用手术器械,生物安全柜,CO2 培养箱,6 孔培养板,T25 培养瓶
品牌 | 货号 | 名称 | 规格 | 保存条件 |
NANOLAB | NA500 | MSC BeautiStemTM XF Basal Medium MSC 无血清基础培养基 | 500ml | 4℃ |
NANOLAB | NAS03 | MSC BeautiStemTM XF Supplement MSC 无血清添加剂 | 3ml | -20℃ |
NANOLAB | NAA01 | MSC Attachment solution (100X) MSC 贴壁试剂 | 1 ml | 4℃ |
NANOLAB | P0500LT | Human Platelet Lysate 血小板裂解物 | 500ml | -20℃ |
表 2 建议选用试剂
NANOLAB | NA079-100ML | Recombinant Trypsin-EDTA Solution 重组胰酶-EDTA | 100ml | RT |
NANOLAB | NA048-20ML | Soybean Trypsin Inhibitor (50X) 大豆胰酶抑制剂 | 20 ml | -20℃ |
NANOLAB | NA712-10ML | MSC Freezing Solution MSC 冻存液 | 10 ml | 4℃ |
NANOLAB | NA023-500ML | DPBS (w/o Ca & Mg) DPBS 缓冲液 | 500 ml | RT |
NANOLAB | NA031-100ML | Penicillin-Streptomycin Solution(100X)青链双抗 | 100ml | -20℃ |
NANOLAB | NA35010100 | MSC ACF Tissue Digestive Mix ACF 高效原代间充质干细胞分离液 | 100ml | -20℃ |
五,实验前准备:
5.1 *培养基的准备
5.1.1 冻存的 MSC BeautiStemTM XF Supplement 在室温或 2-8℃解冻,避免反复冻融。
5.1.2 配制:MSC BeautiStemTM XF Basal Medium(培养基):MSC BeautiStemTM XF
Supplement(添加物):青链双抗=500ml:3ml:5ml,4℃保存,2 周内使用。
注 1:双抗非必须,建议原代(P0)时使用。
注 2:培养基含 L-Glutamine,贮藏时避免长期照光。
5.2 包被培养皿
或跳过此步骤,直接加 2%血小板裂解物(P0500LT),促进 MSC 细胞贴壁与生长。
5.2.1 使用 DPBS 溶液(货号:NA023-500ML),将 MSC 贴壁试剂稀释 100 倍(1:100)。
5.2.2 参照表 3,加入适量的 1XMSC 贴壁试剂涂层培养皿或板。
培养器皿 | 表面积 cm2/孔或瓶 | 1X MSC 贴壁试剂使用体积 |
96 孔板 | 0.34 | 0.05~0.1 ml |
24 孔板 | 1.9 | 0.2~0.4 ml |
12 孔板 | 3.9 | 0.4~0.8 ml |
6 孔板/ 35 cm 培养皿 | 9.6 | 1~2 ml |
T25 瓶/ 60 cm 培养皿 | 25 | 2.5~5 ml |
T75 瓶 | 75 | 7.5~15 ml |
注 1:涂层的培养皿需在无菌条件下 2℃-8℃储存,需在一周内使用。(标示红色为原厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用)
注 2:包被期间, 注意包被液不可以干掉!
注 3:若使用预包被培养瓶(Corning 的 CellBind,货号:3289/3290 等), 步骤 5.2 的包被可略过。
5.2.3 轻轻摇动培养皿,确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后,用封口膜包裹涂层的培养皿。
5.2.4 在 2-8℃孵育过夜;或者在 CO2 培养箱,37℃,至少孵育 30 分钟。
5.2.5 接种前, 吸除贴壁试剂,再用 DPBS 轻轻冲洗培养皿,即可接种细胞。
5.3 制备 1X 大豆胰酶抑制剂
5.3.1 使用无菌的 DPBS,将 50X 大豆胰酶抑制剂(NA048-20ML)稀释成 1X。
6.1.1 无菌条件下取新鲜脐带,用 DPBS 漂洗净血迹
* 一般脐带取得非无菌环境,可以稍微用 75%酒精润洗。
6.1.2 置 10cm 培养皿中,剪成 1~2cm 脐段,剔除血管,用 DPBS 洗净血迹,再剪成 1mm3
组织块。(图 1)
6.1.3 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。
6.1.4 37℃,5%CO2 培养箱孵育 30min,以使组织块粘贴在培养皿壁上。
6.1.5 向每孔滴加 0.8ml *培养基 (注意沿孔壁小心滴加,勿使冲动组织块)。
6.1.6 37℃,5% CO2 培养箱孵育过夜,次日 (D1) 每孔再补加 1ml *培养基。
6.1.7 37℃,5% CO2 继续培养,5 天 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞,但快 3
天就可看到细胞从组织边沿爬出)。
6.1.8 再过 5 天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出,但晚可到 14 天会出现细胞从组织边沿爬出) (图 2、图 3)。
6.1.9 每 2 天换一次培养液,继续培养 2~4 天,待细胞融合度(Confluency)达到约 80%
后传代培养(图 4)。
注 1:组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁,换液动作要尽可能轻微,避免冲动组织块。培养基加量不能太多,以免组织块漂浮。
注 2:为增加成功率,从原代分离脐带和脂肪间充质干细胞, 培养基可加 2.5%的人 AB 血清(人 AB 型血清必须除菌过滤,且 HbsAG 及 HCV/HIV 抗体阴性)。
MSC BeautiStemTM XF Medium 也能有效地培养消化法取得的原代细胞,操做方式可依各实验室的实验步骤,或参考上海中韬 MSC ACF Tissue Digestive Mix (货号:C35010010) 的使用说明。
6.2.1 将脐带用 DPBS 漂洗干净,剪成 1-2cm,后剔除血管。
* 一般脐带取得非无菌环境,可以稍微用 75%酒精润洗。
6.2.2 将组织剪成 3-5mm3 后,移入 50ml 离心管,再加入的分离液。
* 一条长度 10 公分的脐带建议加入 10ml 的分离液;或者组织块 : 分离液(vol)= 1:1。
** 视情况而定,可自行在分离液中添加 1%青链双抗(BI, Cat# 03-031-1B) 。
6.2.3 把 50ml 离心管横放在 37 度细胞培养箱,过夜反应(16 小时)。
* 若总反应体积较大,也可持续旋转混合。
6.2.4 加入和分离液等体积的 0.05%EDTA(NANOLAB, Cat#NA015-100ML)终止反应后,1500 xg 离心5 分钟,去除上清。
* 溶液比较浓稠,小心不要影响下层的细胞;建议留下 5ml 左右的溶液。
** 若是脂肪组织,没有粘稠的情形,以常规的 200-300 xg 离心即可。
*** 没有 EDTA, 可使用无钙镁 DPBS 取代;此时建议后面步骤 6 多重复 2-3 次,以确实去除酵素。
6.2.5 以和分离液等体积的无钙镁 DPBS 重悬细胞后,500 xg 离心 5 分钟,去除上清。
6.2.6 再次以和分离液等体积的无钙镁 DPBS 重悬细胞后,250 xg 离心 5 分钟,去除上清。
6.2.7 用适量的培养基重悬细胞后,即可按常规细胞培养方法接种 P0 代细胞培养。
* 消化后的原代细胞,建议培养时接种密度提高到 10,000/cm2 以上;传代后即可按常规的接种密度培养。
6.3.1 待细胞融和度达到约 80%后进行传代(细胞不能太密集,否则容易分化),吸弃传代板孔中的培养基,每孔加适量 DPBS 轻轻冲洗 1 次。
6.3.2 根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA(货号:NA079-100ML,T25 建议使用 1ml),在 37℃,5% CO2 培养箱作用 3~5 min(可轻拍培养瓶帮助细胞脱落)。
6.3.3 显微镜下观察细胞*脱落后, 根据重组胰酶-EDTA 使用量加入10 倍体积的大豆胰
酶抑制剂(1X),1000rpm 离心 3~5min。例:用 1ml 重组胰酶-EDTA,则加入 1ml
大豆胰酶抑制剂(1X)与细胞混和均匀,再离心。
6.3.4谨慎吸出上清,细胞团块用适当体积的*培养基悬浮后,混匀细胞悬液。
6.3.5 按照所需的比例进行传代或按照 5000-6000cells/cm2 的细胞密度将细胞接种至培养器皿中,放入 37℃, 5% CO2 培养箱内培养。
6.3.6每 2-3 天更换一次培养基, 待细胞融合度达到 80% 左右时,参照操作步骤
6.3.1~6.3.5 做细胞传代;或者参照操作步骤 6.3.1~6.3.3 收获细胞冻存。
6.3.7 细胞冻存:将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 冻存液(货号: NA712-10ML)中,装入冻存管,2~8℃冰箱放置 30min,-80℃冰箱放置 24h,转入液氮罐冻存。
注:本方法仅供参考,用户可根据自身经验做合理调整。附图:(如下是组织块法,建议客户可以尝试消化法)