间充质干细胞无血清培养基

 间充质干细胞无血清培养基

MSC BeautiStemTM XF Medium

一、目的：利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞。二、材料：新生儿脐带

三、主要仪器：医用手术器械，生物安全柜，CO₂ 培养箱，6 孔培养板，T25 培养瓶

四、试剂：

表 1 MSC BeautiStemTM XF Medium

表 2 建议选用试剂

五，实验前准备：

5.1  *培养基的准备

5.1.1 冻存的 MSC BeautiStem^TM XF Supplement 在室温或 2-8℃解冻，避免反复冻融。

5.1.2   配制：MSC  BeautiStem^TM   XF  Basal  Medium（培养基）：MSC  BeautiStem^TM   XF

Supplement（添加物）：青链双抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2 周内使用。

注 1：双抗非必须，建议原代（P0）时使用。

注 2：培养基含 L-Glutamine，贮藏时避免长期照光。

5.2  包被培养皿

或跳过此步骤，直接加 2%血小板裂解物（P0500LT），促进 MSC 细胞贴壁与生长。

          5.2.1 使用 DPBS 溶液（货号：NA023-500ML），将 MSC 贴壁试剂稀释 100 倍（1:100）。

          5.2.2 参照表 3，加入适量的 1XMSC 贴壁试剂涂层培养皿或板。

表 3  涂层过程中贴壁试剂建议使用量

 注 1：涂层的培养皿需在无菌条件下 2℃-8℃储存，需在一周内使用。（标示红色为原厂建议使用量，经过实验测试后可减半使用）

注 2：包被期间， 注意包被液不可以干掉！

注 3：若使用预包被培养瓶（Corning 的 CellBind，货号：3289/3290 等）, 步骤 5.2 的包被可略过。

           5.2.3  轻轻摇动培养皿，确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后，用封口膜包裹涂层的培养皿。

           5.2.4 在 2-8℃孵育过夜；或者在 CO₂ 培养箱，37℃，至少孵育 30 分钟。

           5.2.5 接种前, 吸除贴壁试剂，再用 DPBS 轻轻冲洗培养皿，即可接种细胞。

5.3  制备 1X 大豆胰酶抑制剂

           5.3.1 使用无菌的 DPBS，将 50X 大豆胰酶抑制剂（NA048-20ML）稀释成 1X。

六、使用范例：

6.1  UC-MSC 原代培养 （组织块法）

             6.1.1 无菌条件下取新鲜脐带，用 DPBS 漂洗净血迹

*   一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用 75%酒精润洗。

              6.1.2 置 10cm 培养皿中，剪成 1~2cm 脐段，剔除血管，用 DPBS 洗净血迹，再剪成 1mm3

组织块。(图 1)

               6.1.3 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。

               6.1.4  37℃，5%CO₂ 培养箱孵育 30min，以使组织块粘贴在培养皿壁上。

6.1.5  向每孔滴加 0.8ml *培养基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块)。

 6.1.6  37℃，5% CO₂ 培养箱孵育过夜，次日 (D1) 每孔再补加 1ml *培养基。

                6.1.7 37℃，5% CO₂ 继续培养，5 天 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞，但快 3

天就可看到细胞从组织边沿爬出)。

           6.1.8 再过 5 天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出，但晚可到 14 天会出现细胞从组织边沿爬出) (图 2、图 3)。

 6.1.9 每 2 天换一次培养液，继续培养 2~4 天，待细胞融合度（Confluency）达到约 80%

后传代培养(图 4)。

注 1：组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。

注 2：为增加成功率，从原代分离脐带和脂肪间充质干细胞, 培养基可加 2.5%的人 AB 血清(人 AB 型血清必须除菌过滤，且 HbsAG 及 HCV/HIV 抗体阴性)。

6.2  UC-MSC 原代培养 （消化法）

MSC BeautiStem^TM  XF Medium 也能有效地培养消化法取得的原代细胞，操做方式可依各实验室的实验步骤，或参考上海中韬 MSC ACF Tissue Digestive Mix (货号：C35010010) 的使用说明。

6.2.1  将脐带用 DPBS 漂洗干净，剪成 1-2cm,后剔除血管。

*   一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用 75%酒精润洗。

6.2.2 将组织剪成 3-5mm3 后，移入 50ml 离心管，再加入的分离液。

*   一条长度 10 公分的脐带建议加入 10ml 的分离液；或者组织块 : 分离液（vol）= 1:1。

** 视情况而定，可自行在分离液中添加 1%青链双抗(BI, Cat# 03-031-1B) 。

6.2.3 把 50ml 离心管横放在 37 度细胞培养箱，过夜反应（16 小时）。

*   若总反应体积较大，也可持续旋转混合。

6.2.4 加入和分离液等体积的 0.05%EDTA（NANOLAB, Cat#NA015-100ML）终止反应后，1500 xg 离心5 分钟，去除上清。

*   溶液比较浓稠，小心不要影响下层的细胞;建议留下 5ml 左右的溶液。

** 若是脂肪组织，没有粘稠的情形，以常规的 200-300 xg 离心即可。

*** 没有 EDTA, 可使用无钙镁 DPBS 取代；此时建议后面步骤 6 多重复 2-3 次，以确实去除酵素。

6.2.5 以和分离液等体积的无钙镁 DPBS 重悬细胞后，500 xg 离心 5 分钟，去除上清。

6.2.6 再次以和分离液等体积的无钙镁 DPBS 重悬细胞后，250 xg 离心 5 分钟，去除上清。

6.2.7 用适量的培养基重悬细胞后，即可按常规细胞培养方法接种 P0 代细胞培养。

*   消化后的原代细胞，建议培养时接种密度提高到 10,000/cm2 以上；传代后即可按常规的接种密度培养。

6.3  UC-MSC 传代培养与冻存

        6.3.1   待细胞融和度达到约 80%后进行传代（细胞不能太密集，否则容易分化），吸弃传代板孔中的培养基，每孔加适量 DPBS 轻轻冲洗 1 次。

         6.3.2  根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA（货号：NA079-100ML，T25 建议使用 1ml），在 37℃，5% CO₂ 培养箱作用 3~5 min（可轻拍培养瓶帮助细胞脱落）。

6.3.3 显微镜下观察细胞*脱落后, 根据重组胰酶-EDTA 使用量加入10 倍体积的大豆胰

酶抑制剂（1X），1000rpm 离心 3~5min。例：用 1ml 重组胰酶-EDTA，则加入 1ml

大豆胰酶抑制剂（1X）与细胞混和均匀，再离心。

             6.3.4谨慎吸出上清，细胞团块用适当体积的*培养基悬浮后，混匀细胞悬液。

             6.3.5 按照所需的比例进行传代或按照 5000-6000cells/cm2 的细胞密度将细胞接种至培养器皿中，放入 37℃, 5% CO₂ 培养箱内培养。

             6.3.6每 2-3 天更换一次培养基， 待细胞融合度达到 80% 左右时，参照操作步骤

6.3.1~6.3.5 做细胞传代;或者参照操作步骤 6.3.1~6.3.3 收获细胞冻存。

        6.3.7 细胞冻存：将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×106cells/ml) MSC 冻存液（货号： NA712-10ML）中，装入冻存管，2~8℃冰箱放置 30min，-80℃冰箱放置 24h，转入液氮罐冻存。

注：本方法仅供参考，用户可根据自身经验做合理调整。附图：（如下是组织块法，建议客户可以尝试消化法）